DNA
desnudo
El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para 1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.
Péptidos
fusiogénicos
Los péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.
También se ha visto que los puntos en dónde se da una mayor transferencia son los pulmones y el hígado, con lo que se considera que los transportadores se agrupan en grandes complejos y que interactuan con proteínas de la sangre, con lo que no abandonan eficazmente el sistema vascular, finalmente son retenidos por los filtros naturales del cuerpo, tales como los pulmones o el hígado, en dónde interactuan.
Esto marca dos puntos a superar en este modelo de transferencia de genes in vivo, en primer lugar el superar los filtros naturales que presenta todo organismo, en segundo punto dirigir el transportador dentro del cuerpo con tal de incrementar la afinidad a las células diana.
Una solución propuesta a este último problema es unirlos a ligandos específicos, tales como azúcares, aminoacidos, hormonas,.... Una vez en el tejido adecuado, el proceso de absorción se da por endocitosis formandose un endosoma (en este punto el transportador con el vector han de salir al citoplasma, ya que si no recibirán ataques lisosomales que digerirán el conjunto). Para conseguir una salida se acopla al vector un péptido fusiogena (p.ej. una molécula DOPE, que permite la salida del endosoma por desestabilitzación de les Mbs).
Des del citoplasma, ahora se tiene que dar la entrada al núcleo, este proceso queda detenido por la envoltura nuclear, con la que el vector sólo puede entrar al núcleo en división, cuando se desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura sólo deja pasar por difusión moléculas inferiores a los 9 nanómetros, aunque mediante los transportadores de reconocimiento de la Señal de localización nuclear, podrian entrar moléculas de entre 9-25 nm (los transportadores sintéticos actuales miden más de 25 nm). Lo que nos implica otra nueva dificultad.
